为什么制备固定化酶不宜用包埋法?
制备固定化酶不宜用包埋法的原因:
1,酶的体积比较小,包埋法中使用的载体所形成的孔道要比酶的体积要大,所以如果用包埋法的话酶很难固定在载体内,容易从包埋材料中漏出。
2,包埋法适合固定化细胞。
3,固定化酶是用物理的或化学的方法使酶与水不溶性大分子载体结合或把酶包埋在水不溶性凝胶或半透膜的微囊体中制成的.酶固定化后一般稳定性增加,易从反应系统中分离,且易于控制,能反复多次使用.便于运输和贮存,有利于自动化生产。
石蜡切片的制作步骤(附图)?
1、取材
确定所取材料的来源及部位,纵切还是横切;取材要迅速,防止阻止发生进一步变化,材料体积要适宜,下图为植物芽体取样实拍。
2、固定
最常用的固定液为FAA(万用固定液)。它的优点是材料固定时间不受限制,固定时间短则数小时,长则数月或数年。冲洗或漂洗:组织固定后应充分水洗,除去留在组织内的固定液及其结晶沉淀,否则会影响以后的染色效果。下图为固定液浸泡的组织切块。
3、脱水
目的:水和透明剂不能互溶,只有脱去水分后,才能让透明剂进入。
试剂:梯度酒精溶液
流程:70%—85%—95%–100%— 100% 每步1h-2h左右。
注意事项:保证脱水梯度和每一步脱水时间,水要完全脱净,但也不能过度脱水(过久使组织变脆、收缩,这个时间大家可以根据自己的实验来摸索一下,不必完全按照本操作来)。
下图为自动组织脱水机,适于大量样品组织脱水用。如果材料体积及样品量较少可用小烧杯做容器来进行逐级脱水。
4、浸蜡与包埋
目的:用石蜡取代透明剂,使石蜡浸入组织而起支持作用。
浸蜡程序:(恒温)
(1)低温浸蜡(36℃):接上步,在有二甲苯和材料的烧杯中逐步加碎蜡至过饱和(石蜡不能溶解),过夜12-24h。
(2)高温浸蜡(55-60℃,高于石蜡熔点3℃ ):
将上步二甲苯与石蜡的混合液倒出,不要倒掉材料,将烧杯中加入纯石蜡,共5-24h。纯石蜡需要更换三次。
关于石蜡的选择石蜡熔点:
对于较硬的材料,用熔点较高的石蜡进行包埋;
当切片较薄时(在8μm以下),选用熔点较高的石蜡包埋;
夏季宜采用熔点较高的石蜡(56,58℃),冬季宜选用熔点较低的石蜡(52,54℃)。
5、切片
传统的切片方法是将包埋好的蜡块用刀片修成规整的梯形,粘于小木块上,上机切片。
新型的切片方法是将包埋框(见下图)代替木块的支撑作用,上机切片。切片的厚度可以根据自己的实验要求来确定,一般在8μm-20μm范围内。(下图为传统切片机与新型自动切片机)
6、粘片与烤片
粘片:用粘片剂将蜡片牢附于载玻片上,防止在后续的操作中材料脱落。在载玻片上涂抹粘片剂(甲液),再滴蒸馏水(乙液),放上蜡片,用滤纸吸取多余的水分。
烤片:将载玻片放于40℃展片台中烤干。
7、脱蜡与复水、染色
脱蜡目的:干燥后的切片需脱蜡及复水才能在水溶性染液中进行染色。
复水目的:脱蜡后的材料,如果不经过复水,直接进入染色剂中,材料将会严重变形,甚至难以染色。
染色目的:使细胞组织内的不同结构呈现不同的颜色和足够强的差异以便于观察。
总体流程:二甲苯→1/2 二甲苯+1/2纯酒精→100%酒精→95%酒精→85%酒精→番红(4h以上)→95%酒精→固绿(迅速)→95%酒精(迅速)→100%酒精→1/2 二甲苯+1/2纯酒精→二甲苯→二甲苯,以上各级约需5~10分钟,已注明时间的除外。
染色剂:1%番红(85%酒精配制)
0.5%固绿(95%酒精配制)
8、切片脱水、透明和封固
接上步,在载玻片上滴加适量(1~2滴)中性树胶,再将洁净盖玻片倾斜放下,进行封片。切片放入42℃温箱中干燥过夜。镜检,将合格的切片贴上标签。 封固剂选择加拿大树胶(Canada balsam)或中性树胶。至此,植物组织的石蜡切片大功告成!(下图为加拿大树胶)
包埋法还有什么
包埋法还有涂布法效果和原理都是一样的。涂布法一般指涂布平板法是微生物学实验中的一种操作方法。由于将含菌材料现加到还较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡,而且采用稀释倒平板法。
微生物包括:细菌、病毒、真菌以及一些小型的原生生物、显微藻类等在内的一大类生物群体,它个体微小,与人类关系密切。涵盖了有益跟有害的众多种类,广泛涉及食品、医药、工农业、环保、体育等诸多领域。在我国教科书中,将微生物划分为以下8大类:细菌、病毒、真菌、放线菌、立克次氏体、支原体、衣原体、螺旋体。有些微生物是肉眼可以看见的,像属于真菌的蘑菇、灵芝、香菇等。还有微生物是一类由核酸和蛋白质等少数几种成分组成的“非细胞生物”
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